2 × Pfu PCR mešanica

Predloga A-1

■ Predloga vsebuje beljakovinske nečistoče ali zaviralce Taq itd. - Očistite predlogo DNK, odstranite nečistoče beljakovin ali izvlecite DNA šablone s kompleti za čiščenje.

■ Denaturacija šablone ni popolna - - ustrezno povečajte temperaturo denaturacije in podaljšajte čas denaturacije.

■ Razgradnja predloge-predlogo pripravite znova.

Primer A-2

■ Slaba kakovost temeljnih premazov-Ponovno sintetizirajte temeljni premaz.

■ Razgradnja temeljnega premaza —– Za ohranitev razporedite temeljne premaze z visoko koncentracijo v majhen volumen. Izogibajte se večkratnemu zamrzovanju in odmrzovanju ali dolgotrajnemu kriokonzerviranju pri 4 ° C.

■ Neprimerna zasnova temeljnih premazov (npr. Dolžina premaza ni zadostna, dimer nastane med temeljnimi premazi itd.)

A-3 mg²⁺koncentracija

■ Mg²⁺ koncentracija je prenizka —— Pravilno povečajte Mg²⁺ koncentracija: optimizirajte Mg²⁺ koncentracijo z vrsto reakcij od 1 mM do 3 mM z intervalom 0,5 mM za določitev optimalnega Mg²⁺ koncentracija za vsako šablono in temeljni premaz.

A-4 Temperatura žarjenja

■ Visoka temperatura žarjenja vpliva na vezavo temeljnega premaza in šablone. —— Zmanjšajte temperaturo žarjenja in optimizirajte stanje z naklonom 2 ° C.

A-5 Podaljšanje časa

■ Kratek čas podaljšanja —— podaljšajte čas podaljšanja.

Fenomeni: Negativni vzorci prikazujejo tudi pasove ciljnega zaporedja.

A-1 Kontaminacija PCR

■ navzkrižna kontaminacija ciljnega zaporedja ali produktov pomnoževanja - previdno, da vzorca, ki vsebuje ciljno zaporedje, ne pipetirate v negativni vzorec ali ga razlijete iz epruvete za centrifugiranje. Reagente ali opremo je treba avtoklavirati, da se odstranijo obstoječe nukleinske kisline, obstoj kontaminacije pa je treba ugotoviti s poskusi negativne kontrole.

■ Kontaminacija reagentov —— Razredčite reagente in jih shranite pri nizki temperaturi.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ koncentracija je prenizka —— Pravilno povečajte Mg²⁺ koncentracija: optimizirajte Mg²⁺ koncentracijo z vrsto reakcij od 1 mM do 3 mM z intervalom 0,5 mM za določitev optimalnega Mg²⁺ koncentracija za vsako šablono in temeljni premaz.

■ Nepravilna zasnova temeljnega premaza in ciljno zaporedje ima homologijo z neciljnim zaporedjem. —— Premazi za ponovno oblikovanje.

Fenomeni: Amplitski pasovi PCR niso skladni s pričakovano velikostjo, bodisi veliki ali majhni, včasih pa se pojavijo tako specifični ojačevalni pasovi kot nespecifični ojačevalni pasovi.

Primer A-1

■ Slaba specifičnost temeljnega premaza

—— Premaz za ponovno oblikovanje.

■ Koncentracija temeljnega premaza je previsoka - Pravilno povečajte temperaturo denaturacije in podaljšajte čas denaturacije.

A-2 mg²⁺ koncentracija

■ Mg²⁺ koncentracija je previsoka —— Pravilno zmanjšajte koncentracijo Mg2+: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracijo z vrsto reakcij od 1 mM do 3 mM z intervalom 0,5 mM za določitev optimalnega Mg²⁺ koncentracija za vsako šablono in temeljni premaz.

A-3 Termostabilna polimeraza

■ Prekomerna količina encima - - Zmanjšajte količino encima v intervalih 0,5 U.

A-4 Temperatura žarjenja

■ Temperatura žarjenja je prenizka--ustrezno povečajte temperaturo žarjenja ali uporabite dvostopenjsko metodo žarjenja

A-5 PCR cikli

■ Preveč ciklov PCR - Zmanjšajte število ciklov PCR.

Primer A-1—— Slaba specifičnost ——Načrtujte temeljni premaz, spremenite položaj in dolžino temeljnega premaza, da povečate njegovo specifičnost; ali izvedite ugnezdeni PCR.

Predloga DNK A-2

—— Predloga ni čista —— Očistite predlogo ali izvlecite DNA s kompleti za čiščenje.

A-3 mg²⁺ koncentracija

——Mg²⁺ koncentracija je previsoka - pravilno zmanjšajte Mg²⁺ koncentracija: optimizirajte Mg²⁺ koncentracijo z vrsto reakcij od 1 mM do 3 mM z intervalom 0,5 mM za določitev optimalnega Mg²⁺ koncentracija za vsako šablono in temeljni premaz.

A-4 dNTP

—— Koncentracija dNTP je previsoka —— Ustrezno zmanjšajte koncentracijo dNTP

A-5 Temperatura žarjenja

—— Prenizka temperatura žarjenja —— Primerno povečajte temperaturo žarjenja

A-6 cikli

—— Preveč ciklov —— Optimizirajte število ciklov

Prvi korak je izbira ustrezne polimeraze. Navadne Taq polimeraze ni mogoče lektorirati zaradi pomanjkanja 3'-5 'eksonukleazne aktivnosti, neujemanje pa bo močno zmanjšalo učinkovitost podaljšanja fragmentov. Zato navadna Taq polimeraza ne more učinkovito ojačati ciljnih fragmentov, večjih od 5 kb. Taq polimerazo s posebno modifikacijo ali drugo polimerazo visoke zvestobe je treba izbrati za izboljšanje učinkovitosti podaljšanja in zadovoljevanje potreb po pomnoževanju z dolgimi fragmenti. Poleg tega je za ojačanje dolgih fragmentov potrebna tudi ustrezna prilagoditev zasnove temeljnega premaza, čas denaturacije, čas podaljšanja, pH pufra itd. Običajno lahko temeljni premazi z 18-24 bp vodijo do boljšega pridelka. Da bi preprečili poškodbe šablone, je treba čas denaturacije pri 94 ° C skrajšati na 30 sekund ali manj na cikel, čas za dvig temperature na 94 ° C pred ojačitvijo pa manj kot 1 minuto. Poleg tega lahko nastavitev temperature podaljška na približno 68 ° C in načrtovanje časa podaljšanja glede na hitrost 1 kb/min zagotovita učinkovito ojačanje dolgih fragmentov.

Stopnjo napake pri amplifikaciji PCR lahko zmanjšamo z uporabo različnih DNA polimeraz z visoko zvestobo. Med vsemi doslej odkritimi polimerazami Taq DNA ima encim Pfu najnižjo stopnjo napak in najvišjo zvestobo (glej priloženo tabelo). Poleg izbire encimov lahko raziskovalci dodatno zmanjšajo stopnjo mutacije PCR z optimizacijo reakcijskih pogojev, vključno z optimizacijo sestave pufra, koncentracijo termostabilne polimeraze in optimizacijo števila ciklov PCR.