Čiste kroglice TIANSeq RNA

Trenutno visokozmogljiva tehnologija zaporedja večinoma temelji na tehnologiji sekvenciranja naslednje generacije. Ker je dolžina branja naslednje generacije tehnologije zaporedja omejena, moramo celotno dolžino zaporedja razdeliti na knjižnice majhnih fragmentov. Glede na potrebe različnih poskusov zaporedja običajno izberemo enojno zaporedje ali dvojno zaporedje. Trenutno so fragmenti DNA knjižnice za sekvenciranje naslednje generacije na splošno razporejeni v območju 200-800 bp.

a) DNA je slabe kakovosti in vsebuje inhibitorje. Uporabite kakovostne vzorce DNK, da se izognete zaviranju aktivnosti encima.

b) Količina vzorca DNK ni zadostna, če za izdelavo knjižnice DNA uporabljamo metodo brez PCR. Ko vnos razdrobljene DNA preseže 50 ng, se lahko med postopkom gradnje knjižnice selektivno izvede potek dela brez PCR. Če je številka kopije knjižnice prenizka, da bi jo lahko neposredno sekvencirali, lahko knjižnico DNA po ligaciji adapterja ojačamo s PCR.

c) Kontaminacija RNA vodi do netočne začetne kvantifikacije DNK Kontaminacija RNA lahko obstaja v postopku čiščenja genomske DNA, kar lahko privede do netočne kvantifikacije DNA in nezadostne obremenitve DNK med gradnjo knjižnice. RNA lahko odstranimo z zdravljenjem z RNazo.

A-1

a) Pojavijo se majhni drobci (60 bp-120 bp) Majhni drobci so običajno fragmenti adapterja ali dimerji, ki jih tvorijo adapterji. Čiščenje z magnetnimi kroglicami Agencourt AMPure XP lahko učinkovito odstrani te fragmente adapterja in zagotovi kakovost sekvenciranja.

b) Po razširitvi PCR se v knjižnici pojavijo veliki fragmenti Velikost knjižnega fragmenta DNA se bo po ligaciji adapterja povečala za 120 bp. Če se fragment DNA po povezovanju adapterja poveča za več kot 120 bp, je to lahko posledica nenormalne amplifikacije fragmenta zaradi prekomerne amplifikacije PCR. Zmanjšanje števila ciklov PCR lahko situacijo prepreči.

c) Nenormalna velikost fragmentov DNK knjižnice po vezavi adapterja Dolžina adapterja v tem kompletu je 60 bp. Ko se dva konca fragmenta povežeta z adapterji, se bo dolžina povečala le za 120 bp. Če uporabljate adapter, ki ni priložen temu kompletu, se obrnite na dobavitelja, da vam posreduje ustrezne informacije, na primer dolžino adapterja. Poskrbite, da potek dela in delovanje poskusa sledijo korakom, opisanim v priročniku.

d) Nenormalna velikost fragmenta DNA pred ligacijo adapterja Razlog za to težavo so lahko napačni reakcijski pogoji med fragmentacijo DNA. Za različne vnose DNK je treba uporabiti različne reakcijske čase. Če je vnos DNK večji od 10 ng, priporočamo, da kot začetni čas za optimizacijo izberete reakcijski čas 12 minut, velikost fragmenta, ki je v tem času nastala, pa je v glavnem v območju 300-500 bp. Uporabniki lahko povečajo ali zmanjšajo dolžino fragmentov DNA za 2-4 minute v skladu s svojimi zahtevami, da optimizirajo fragmente DNA z zahtevano velikostjo.

A-2

a) Čas fragmentacije ni optimiziran Če je razdrobljena DNA premajhna ali prevelika, prosimo, da za določitev reakcijskega časa uporabite navodila za izbiro časa fragmentacije in uporabite to časovno točko kot kontrolo, dodatno nastavite reakcijski sistem podaljša ali skrajša 3 minute, da se natančneje prilagodi čas drobljenja.

A-3

Nenormalna porazdelitev DNA po velikosti po obdelavi z drobljenjem

a) Nepravilna metoda odmrzovanja reagenta za fragmentacijo ali po odmrzovanju reagent ni popolnoma premešan. 5x reagent za fragmentacijo encimske mešanice odmrznite na ledu. Po odmrznitvi enakomerno premešajte reagent tako, da nežno udarite po dnu epruvete. Ne vrtinčite reagenta!

b) Vhodni vzorec DNK vsebuje EDTA ali druga onesnaževala. Izčrpavanje soli soli in kelatnih sredstev v koraku čiščenja DNA je še posebej pomembno za uspeh poskusa. Če se DNA raztopi v 1 × TE, uporabite metodo, navedeno v navodilih, za izvedbo fragmentacije. Če je koncentracija EDTA v raztopini negotova, je priporočljivo očistiti DNA in jo raztopiti v deionizirani vodi za nadaljnjo reakcijo.

c) Netočna začetna količinska opredelitev DNK Velikost razdrobljene DNK je tesno povezana s količino vnesene DNK. Pred obdelavo fragmentacije je za določitev natančne količine DNA v reakcijskem sistemu bistvena natančna količinska opredelitev DNK z uporabo Qubit, Picogreen in drugih metod.

 d) Priprava reakcijskega sistema ne sledi navodilom Priprava razdrobljenega reakcijskega sistema mora biti izvedena na ledu strogo v skladu z navodili. Da bi zagotovili najboljši učinek, je treba vse reakcijske komponente položiti na led, pripravo reakcijskega sistema pa opraviti po popolnem ohlajanju. Ko je priprava končana, z miško ali pipeto temeljito premešajte. Ne vrtinčite!

1. Nepravilna metoda mešanja (vrtinec, silovito nihanje itd.) Bo povzročila nenormalno porazdelitev fragmentov knjižnice (kot je prikazano na naslednji sliki), kar bo vplivalo na kakovost knjižnice. Zato pri pripravi reakcijske raztopine fragmentacijske mešanice nežno pipetirajte navzgor in navzdol za mešanje ali pa s prstom enakomerno drgnite in premešajte. Pazite, da se ne mešate z vrtinčenjem.

2. Za gradnjo knjižnice je treba uporabiti DNA visoke čistosti

■ Dobra celovitost DNK: Elektroforezni pas je večji od 30 kb, brez sledenja

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1,7-1,9

3. Vnesena količina DNK mora biti točna. Za količinsko opredelitev DNK se namesto Nanodropa priporoča uporaba metod Qubit in PicoGreen.

4. Vsebnost EDTA v raztopini DNA je treba določiti EDTA ima velik vpliv na reakcijo fragmentacije. Če je vsebnost EDTA visoka, je treba pred naslednjim preskusom opraviti čiščenje DNK.

5. Reakcijsko raztopino za razdrobitev je treba pripraviti na ledu. Postopek fragmentacije je občutljiv na temperaturo in čas reakcije (zlasti po dodajanju ojačevalca). Za zagotovitev natančnosti reakcijskega časa, prosimo, pripravite reakcijski sistem na ledu.

6. Reakcijski čas fragmentacije mora biti točen. Reakcijski čas koraka fragmentacije bo neposredno vplival na velikost produktov fragmentov in tako vplival na porazdelitev velikosti fragmentov DNA v knjižnici.

1. Kakšen vzorec se uporablja za ta komplet?

Vrsta vzorca tega kompleta je lahko celotna RNA ali očiščena mRNA z dobro integriteto RNA. Če se za izdelavo knjižnice uporablja celotna RNA, je za odstranitev rRNA najprej priporočljivo uporabiti komplet za zmanjševanje rRNA (Cat#4992363/4992364/4992391).

2. Ali je mogoče za izdelavo knjižnice s tem kompletom uporabiti vzorce FFPE?

MRNA v vzorcih FFPE se bo do neke mere razgradila z relativno slabo integriteto. Ko uporabljate ta komplet za gradnjo knjižnice, je priporočljivo optimizirati čas razdrobljenosti (skrajšati čas razdrobljenosti ali ne izvajati razdrobljenosti).

3. Kaj bi lahko povzročilo rahlo odstopanje pri vstavljenem segmentu z uporabo koraka izbire velikosti v priročniku za izdelek?

Izbira velikosti se izvede strogo v skladu s korakom izbire velikosti v tem priročniku za izdelek. Če pride do odstopanja, je lahko razlog v tem, da magnetne kroglice niso uravnotežene na sobno temperaturo ali niso popolnoma premešane, pipeta ni natančna ali pa je tekočina ostala v konici. Za poskus je priporočljivo uporabiti konice z nizko adsorpcijo.

4. Izbira adapterjev pri gradnji knjižnic

Komplet za izdelavo knjižnice ne vsebuje reagenta za adapter, zato je priporočljivo, da ga uporabite skupaj z enosmernim vmesnikom TIANSeq (Illumina) (4992641/4992642/4992378).

5. QC knjižnice

Kvantitativno odkrivanje knjižnice: Qubit in qPCR se uporabljata za določanje masne koncentracije oziroma molarne koncentracije knjižnice. Delovanje je strogo v skladu z navodili za uporabo. Koncentracija knjižnice bo na splošno ustrezala zahtevam zaporedja NGS. Zaznavanje obsega distribucije knjižnic: Z uporabo bioanalizatorja Agilent 2100 za odkrivanje obsega distribucije knjižnice.

6. Izbira številke cikla ojačanja

V skladu z navodili je število ciklov PCR 6-12, število potrebnih ciklusov PCR pa je treba izbrati glede na vnos vzorca. V knjižnicah z visokim donosom običajno pride do prekomernega povečanja v različnih stopnjah, kar se kaže z nekoliko večjim vrhom po vrhuncu ciljnega območja pri odkrivanju bioanalizatorja Agilent 2100 ali pa je zaznana koncentracija Qubita nižja od koncentracije qPCR. Blago povečanje je normalen pojav, ki ne vpliva na zaporedje knjižnic in kasnejšo analizo podatkov.

7. Konice se pojavijo v profilu zaznavanja bioanalizatorja Agilent 2100

Pojav konic pri odkrivanju bioanalizatorja Agilent 2100 je posledica neenakomerne razdrobljenosti vzorcev, kjer bo več fragmentov v določeni velikosti, kar bo postalo bolj očitno po obogatitvi s PCR. V tem primeru se predlaga, da se ne izvede izbira velikosti, to je, da se za 15 minut inkubiranja določi pogoj razdrobljenosti na 94 ° C, kjer je porazdelitev drobcev majhna in koncentrirana, homogenost pa je mogoče izboljšati.