Komplet za neposredno krvno preiskavo krvi

Hitro pomnoževanje ciljnega gena neposredno z uporabo krvi kot predloge brez ekstrakcije.

Ta komplet uporablja gensko spremenjeno anti-inhibitorno DNA polimerazo za učinkovito ojačanje genov z eno kopijo v človeškem genomu. Dobro optimiziran puferski sistem v tem kompletu pomaga polimerazi, da se močno upira zaviranju zaviralcev PCR, zato lahko neposredno ojača DNA z uporabo krvi in kultiviranih celic kot šablon. Ta izdelek je enostaven za uporabo in ne zahteva zapletenih korakov, kot sta čiščenje DNK ali predhodna obdelava vzorcev.
Ta komplet je na voljo kot 2 × MasterMix, reakcijo pa lahko izvedete tako, da preprosto dodate krvno šablono in ustrezne detekcijske podlage. Uporablja se lahko na kultiviranih celicah sesalcev, kot so ljudje, miši, prašiči, govedo in druge vrste, pa tudi na svežo ali 4 ℃ kriokonzervirano polno kri, antikoagulant (EDTA, citrat, heparin), utekočinjene krvne strdke in suhe krvne madeže shranjene na komercialnih karticah Whatman 903 in FTA Elute.

Mačka. Ne	Velikost pakiranja
4992529	20 µl × 100 rxn
4992530	20 µl × 500 rxn

Pošljite nam e -pošto

Podrobnosti o izdelku

Eksperimentalni primer

Pogosta vprašanja

Oznake izdelkov

Lastnosti

■ Enostavno in hitro: amplifikacijo PCR lahko neposredno izvedemo s krvjo kot predlogo, brez potrebe po mučnih korakih priprave vzorca in ekstrakcije DNA.
■ Visoka čistost: Preskok korakov predhodne obdelave vzorcev in ekstrakcije DNA lahko pomaga preprečiti navzkrižno kontaminacijo vzorcev.
■ Visoka prepustnost: PCR identifikacijo za velike vzorce je mogoče izvesti s kombinacijo kompleta s 96/384 vdolbinicami PCR.
■ Močna univerzalnost: Ta komplet lahko učinkovito ojača fragmente visokega GC ali fragmente s kompleksno sekundarno strukturo, dolžina ojačitve pa je lahko do 5 kb.
■ Močna odpornost na stres: Ta komplet se lahko uporablja za različne vrste in vzorce krvi, shranjene na različne načine.

Aplikacije

Izdelki PCR tega kompleta vsebujejo "A" na koncu 3′, ki ga lahko neposredno uporabimo za kloniranje vektorja TA. Ta komplet se lahko uporablja za pomnoževanje genomskih fragmentov DNK, visoko zmogljivo genetsko analizo in analizo genotipizacije (kot je odkrivanje genov).

Vse izdelke je mogoče prilagoditi za ODM/OEM. Za podrobnosti,kliknite prilagojeno storitev (ODM/OEM)

Prejšnji: TIANcombi DNA Lyse & Det PCR komplet

Naslednji: Komplet PCR za mišično tkivo

	Z uporabo antikoagulacije humane EDTA kot predloge smo s pomočjo Direct Direct PCR Kit pomnožili 4 gene z različno vsebnostjo GC. Reakcijski sistem PCR je bil 20 μl, 1 μl krvi pa smo uporabili kot šablono. M: TIANGEN Marker II; 1: Velikost fragmenta 1090 bp, vsebnost GC 68,1%; 2: Velikost fragmenta 1915 bp, vsebnost GC 70,4%; 3: Velikost fragmenta 448 bp, vsebnost GC 74,8%; 4: Velikost fragmenta 1527 bp, vsebnost GC 61,5%. Eksperimentalni rezultati: Komplet PCR za neposredno krvno krmiljenje lahko učinkovito ojača fragmente DNK z vsebnostjo GC v razponu od 61,5%do 74,8%, kar kaže, da je sposoben ojačati fragmente z visokim GC.
	Z uporabo antikoagulacije humane EDTA kot šablone smo 5 genov z različnimi dolžinami (ActB, Prp, DN1.0, Hn2.0 in Hn4.0) pomnožili s kompletom za neposredno krvno preiskavo krvi. Reakcijski sistem PCR je bil 20 μl, 1 μl krvi pa smo uporabili kot šablono. M: TIANGEN Marker II; 1-3: 3 različni vzorci krvi; NTC: krmiljenje brez temeljnih premazov. Eksperimentalni rezultati: Komplet za neposredno PCR s krvjo lahko ojača fragmente dolžine do 4 kb, kar kaže, da je sposoben pomnožiti dolge fragmente.
	Z uporabo antikoagulantov humanega EDTA kot predloge je bil za neposredno PCR odkrivanje različnih vzorcev krvi uporabljen komplet Blood Direct PCR Kit. Reakcijski sistem PCR je bil 20 μl, 1 μl krvi pa smo uporabili kot šablono. M: TIANGEN Marker II; 1-9: polnilna količina krvi je 0,1 μl, 0,2 μl, 0,3 μl, 0,4 μl, 1 μl, 2 μl, 3 μl, 4 μl oziroma 5 μl; NTC: nadzor brez predloge Eksperimentalni rezultati: Komplet za neposredno krvno preiskavo krvi Direct ima močno odpornost na kri in lahko ojača vzorce krvi z območjem nalaganja 0,1-5 μl.
	Kot vzorci so bili uporabljeni vzorci krvi ljudi, podgan, piščancev in drugih vrst z različnimi obdelavami. Blood Direct PCR Kit smo uporabili za ojačanje PRNP (človeški, 750 bp), aktin (podgana, 200 bp) in β-aktin (piščanec, 1,0 kb). Reakcijski sistem PCR je bil 20 μl, 1 μl krvi pa smo uporabili kot šablono. M: TIANGEN Marker II. Eksperimentalni rezultati: Komplet PCR za neposredno krvno kontrolo lahko uporabimo na številnih vzorcih, neposredno odkrivanje PCR pa lahko opravimo na vzorcih krvi različnih vrst z različnimi obdelavami.

V: Brez ojačevalnih pasov

Predloga A-1

■ Predloga vsebuje beljakovinske nečistoče ali zaviralce Taq itd. - Očistite predlogo DNK, odstranite nečistoče beljakovin ali izvlecite DNA šablone s kompleti za čiščenje.

■ Denaturacija šablone ni popolna - - ustrezno povečajte temperaturo denaturacije in podaljšajte čas denaturacije.

■ Razgradnja predloge-predlogo pripravite znova.

Primer A-2

■ Slaba kakovost temeljnih premazov-Ponovno sintetizirajte temeljni premaz.

■ Razgradnja temeljnega premaza —– Za ohranitev razporedite temeljne premaze z visoko koncentracijo v majhen volumen. Izogibajte se večkratnemu zamrzovanju in odmrzovanju ali dolgotrajnemu kriokonzerviranju pri 4 ° C.

■ Neprimerna zasnova temeljnih premazov (npr. Dolžina premaza ni zadostna, dimer nastane med temeljnimi premazi itd.)

A-3 mg²⁺koncentracija

■ Mg²⁺ koncentracija je prenizka —— Pravilno povečajte Mg²⁺koncentracija: optimizirajte Mg²⁺ koncentracijo z vrsto reakcij od 1 mM do 3 mM z intervalom 0,5 mM za določitev optimalnega Mg²⁺ koncentracija za vsako šablono in temeljni premaz.

A-4 Temperatura žarjenja

■ Visoka temperatura žarjenja vpliva na vezavo temeljnega premaza in šablone. —— Zmanjšajte temperaturo žarjenja in optimizirajte stanje z naklonom 2 ° C.

A-5 Podaljšanje časa

■ Kratek čas podaljšanja —— podaljšajte čas podaljšanja.

V: Lažno pozitivno

Fenomeni: Negativni vzorci prikazujejo tudi pasove ciljnega zaporedja.

A-1 Kontaminacija PCR

■ navzkrižna kontaminacija ciljnega zaporedja ali produktov pomnoževanja - previdno, da vzorca, ki vsebuje ciljno zaporedje, ne pipetirate v negativni vzorec ali ga razlijete iz epruvete za centrifugiranje. Reagente ali opremo je treba avtoklavirati, da se odstranijo obstoječe nukleinske kisline, obstoj kontaminacije pa je treba ugotoviti s poskusi negativne kontrole.

■ Kontaminacija reagentov —— Razredčite reagente in jih shranite pri nizki temperaturi.

A-2 Primer

■ Mg²⁺ koncentracija je prenizka —— Pravilno povečajte Mg²⁺ koncentracija: optimizirajte Mg²⁺ koncentracijo z vrsto reakcij od 1 mM do 3 mM z intervalom 0,5 mM za določitev optimalnega Mg²⁺ koncentracija za vsako šablono in temeljni premaz.

■ Nepravilna zasnova temeljnega premaza in ciljno zaporedje ima homologijo z neciljnim zaporedjem. —— Premazi za ponovno oblikovanje.

V: Nespecifično ojačanje

Fenomeni: Amplitski pasovi PCR niso skladni s pričakovano velikostjo, bodisi veliki ali majhni, včasih pa se pojavijo tako specifični ojačevalni pasovi kot nespecifični ojačevalni pasovi.

Primer A-1

■ Slaba specifičnost temeljnega premaza

—— Premaz za ponovno oblikovanje.

■ Koncentracija temeljnega premaza je previsoka - Pravilno povečajte temperaturo denaturacije in podaljšajte čas denaturacije.

A-2 mg²⁺ koncentracija

■ Mg²⁺ koncentracija je previsoka —— Pravilno zmanjšajte koncentracijo Mg2+: Optimizirajte Mg²⁺ koncentracijo z vrsto reakcij od 1 mM do 3 mM z intervalom 0,5 mM za določitev optimalnega Mg²⁺ koncentracija za vsako šablono in temeljni premaz.

A-3 Termostabilna polimeraza

■ Prekomerna količina encima - - Zmanjšajte količino encima v intervalih 0,5 U.

A-4 Temperatura žarjenja

■ Temperatura žarjenja je prenizka--ustrezno povečajte temperaturo žarjenja ali uporabite dvostopenjsko metodo žarjenja

A-5 PCR cikli

■ Preveč ciklov PCR - Zmanjšajte število ciklov PCR.

V: Zamašeni ali razmazani trakovi

Primer A-1—— Slaba specifičnost ——Načrtujte temeljni premaz, spremenite položaj in dolžino temeljnega premaza, da povečate njegovo specifičnost; ali izvedite ugnezdeni PCR.

Predloga DNK A-2

—— Predloga ni čista —— Očistite predlogo ali izvlecite DNA s kompleti za čiščenje.

A-3 mg²⁺ koncentracija

——Mg²⁺ koncentracija je previsoka - pravilno zmanjšajte Mg²⁺ koncentracija: optimizirajte Mg²⁺ koncentracijo z vrsto reakcij od 1 mM do 3 mM z intervalom 0,5 mM za določitev optimalnega Mg²⁺ koncentracija za vsako šablono in temeljni premaz.

A-4 dNTP

—— Koncentracija dNTP je previsoka —— Ustrezno zmanjšajte koncentracijo dNTP

A-5 Temperatura žarjenja

—— Prenizka temperatura žarjenja —— Primerno povečajte temperaturo žarjenja

A-6 cikli

—— Preveč ciklov —— Optimizirajte število ciklov

V: Koliko vzorčne DNA je treba dodati v 50 μl reakcijski sistem PCR?

V: Kako povečati dolge fragmente?

Prvi korak je izbira ustrezne polimeraze. Navadne Taq polimeraze ni mogoče lektorirati zaradi pomanjkanja 3'-5 'eksonukleazne aktivnosti, neujemanje pa bo močno zmanjšalo učinkovitost podaljšanja fragmentov. Zato navadna Taq polimeraza ne more učinkovito ojačati ciljnih fragmentov, večjih od 5 kb. Taq polimerazo s posebno modifikacijo ali drugo polimerazo visoke zvestobe je treba izbrati za izboljšanje učinkovitosti podaljšanja in zadovoljevanje potreb po pomnoževanju z dolgimi fragmenti. Poleg tega je za ojačanje dolgih fragmentov potrebna tudi ustrezna prilagoditev zasnove temeljnega premaza, čas denaturacije, čas podaljšanja, pH pufra itd. Običajno lahko temeljni premazi z 18-24 bp vodijo do boljšega pridelka. Da bi preprečili poškodbe šablone, je treba čas denaturacije pri 94 ° C skrajšati na 30 sekund ali manj na cikel, čas za dvig temperature na 94 ° C pred ojačitvijo pa manj kot 1 minuto. Poleg tega lahko nastavitev temperature podaljška na približno 68 ° C in načrtovanje časa podaljšanja glede na hitrost 1 kb/min zagotovita učinkovito ojačanje dolgih fragmentov.

V: Kako izboljšati zvestobo amplifikacije PCR?

Stopnjo napake pri amplifikaciji PCR lahko zmanjšamo z uporabo različnih DNA polimeraz z visoko zvestobo. Med vsemi doslej odkritimi polimerazami Taq DNA ima encim Pfu najnižjo stopnjo napak in najvišjo zvestobo (glej priloženo tabelo). Poleg izbire encimov lahko raziskovalci dodatno zmanjšajo stopnjo mutacije PCR z optimizacijo reakcijskih pogojev, vključno z optimizacijo sestave pufra, koncentracijo termostabilne polimeraze in optimizacijo števila ciklov PCR.

Tukaj napišite svoje sporočilo in nam ga pošljite